GENÉTICA, EPIGENÉTICA Y BIOLOGÍA CELULAR

El objetivo fundamental del laboratorio de Investigación es facilitar los recursos técnicos y humanos necesarios a los grupos adscritos a Bioaraba que requieran para el desarrollo de sus proyectos de técnicas de (epi)genética y/o genómica, o de cultivos o modelos celulares.

Puesta a punto y realización de experimentos en los que se empleen las técnicas que explican a continuación

Técnicas Biología Molecular

• Extracción y purificación de ácidos nucleicos. Cuantificación, análisis de calidad y preparación de los mismos para posteriores estudios.
• Amplificación mediante (RT-)PCR de cualquier amplicón solicitado (DNA o RNA).
• PCR fluorescente y electroforesis capilar
• PCR específica de alelo para determinación de origen alélico de una variante de novo o sin acceso a muestra de progenitores.
• Estudio mRNA de variantes de splicing.
• Búsqueda y determinación de variantes genéticas de interés. Mediante las técnicas:
  • Secuenciación Sanger (Analizadores genéticos ABI3500).
  • Secuenciación masiva. Diseño de paneles para la captura de la región genómica de interés y su posterior secuenciación (MiniSeq Illumina).

• Búsqueda y determinación de variaciones en el número de copias de una región genómica.
  • Mediante microsatélites (PCR fluorescente y electroforesis capilar)
  • MLPA (diseños comerciales o propios)

• Estudio de disomía uniparental
• Estudio de metilación de regiones improntadas
  • MS-MLPA
  • Pirosecuenciación

• Estudios de expresión génica mediante
  • qRT-PCR. (7500 PCR Real Time System-Applied Biosystems).

• Análisis secundario de datos NGS DNA-seq (paneles y exomas).

Pruebas Genética Molecular

• Aislamiento de células a partir de muestras de pacientes.
• Mantenimiento de cultivos celulares. Pudiéndose hacer tanto de líneas primarias (extraídas directamente del paciente) como de cultivos inmortalizados. Desde la Plataforma se puede trabajar con cualquier tipo celular que no requiera de unos sistemas de bioseguridad especiales.
• Caracterización del crecimiento celular, realizando curvas de crecimiento. Asimismo, se puede estudiar la viabilidad celular.
• Visualización microscópica de cultivos celulares, pudiendo capturar imágenes del mismo.
• Conservación de muestras celulares.
• ELISAs, teniendo en cuenta que el fluoróforo utilizado pueda ser leído por el lector de placas.
• Marcajes fluorescentes de células y su visualización. Se pueden tomar instantáneas en el campo claro, verde, rojo y/o azul y se puede hacer una superposición de las mismas. De esta manera podría verse la disposición celular del elemento marcado o incluso la colocalización entre diferentes componentes.
• Con el apoyo del laboratorio de genética y epigenética molecular se pueden realizar los estudios con ácidos nucleicos explicados anteriormente.
• Transfecciones celulares.
• Técnicas de modificación genética.

Asesoramiento y apoyo a los/as investigadores/as en la elaboración de protocolos y artículos en todos aquellos términos que estén relacionados con la epigenética, genómica y cultivos celulares.

Infraestructura básica de laboratorio

• Material básico de laboratorio como micropipetas, multipipetas (8 canales), pipetas automáticas, vortex, termobloques (Hybex) de tubos y placas con agitación.
• Termocicladores de 96 pocillos, gradiente vertical (C1000 y T-1000, BioRad) y horizontal (Verity, Life Technologies)
• Equipo para análisis y documentación de geles ChemiDoc XR (Bio-rad)
• Sistema electroforesis en gel agarosa y Sistema Western Blot
• Centrifuga y microcentrifuga refrigeradas
• Campana de aspiración de mesa con esterilización ultravioleta de UVP.
• Balanza (200 g-011 mg),
• Equipos de refrigeración, congelación y criopreservación (-80 ºC).

Extracción, cuantificación y determinación de calidad ácidos nucleicos

• Robot de extracción de ácidos nucleicos QIAcube (QIAGEN). Permite el procesamiento de 12 muestras en paralelo.
• Espectrofotómetro de microvolúmenes Nanodrop One-C (Thermo Scientific). Permite la cuantificación y análisis de calidad de muestras de ADN, ARN y proteínas. Además, también permite identificar contaminantes presentes en las muestras que pudieran interferir en el desarrollo de los experimentos.
• Fluorímetro Qubit 3 (Invitrogen-Thermo Fisher Scientific). Permite cuantificar con una gran sensibilidad y precisión DNA, RNA y proteínas, eliminándose el efecto negativo que producen los contaminantes en la cuantificación. Aplicaciones específicas: cuantificación de ácidos nucleicos para posteriores técnicas como qPCR, NGS, cuantificación de proteínas o análisis de calidad de las librerías para NGS.
• Acceso al uso del LabChip® GX Touch™ (Perkin Elmer). Permite analizar muestras de DNA y RNA mediante electroforesis capilar, de manera cuantitativa (concentración) y cualitativa (calidad y tamaño). Aplicaciones específicas: cuantificación y valoración de la calidad de las librerías de NGS.

Secuenciadores y/o analizadores genéticos

• Analizador genético ABI3500 (Life Technologies). Aplicaciones específicas: Secuenciación Sanger (amplicones de hasta 700-800 pb), análisis de microsatélites (rango real 60-560 pb), pérdida de heterozigosidad (LOH), MLPA/MS-MLPA, QMPSF, …
• Sistema de secuenciación de NGS por síntesis MiniSeq (Illumina). Se trata de un Secuenciador masivo (Next-generation Sequencing). Aplicaciones específicas: está dirigido principalmente al estudio de paneles de genes o dianas genómicas concretas, genomas pequeños completos (bacterias, virus), estudio de perfiles de expresión de RNA o small RNA (estudio de 1 a 96 dianas de RNA). Permite realizar carreras de media (Mid Output: 2.4 gigabases | Pair-end 150 | 8M de clusters) o alta capacidad (High Output: 7.5 gigabases | Pair-end 150 | 25M de clusters).
• Sistema 7500 Real time PCR. Permite realizar PCR/RT-PCR a tiempo real en formato de placa de 96 muestras para la cuantificación absoluta y relativa de ácidos nucleicos.
• PCR cuantitativa por High resolution melt analysis (HRM). Esta tecnología se basa en la curva de fusión de la PCR y permite discriminar las secuencias de DNA en función de su composición, longitud, contenido de GC o complementariedad de la cadena. Por lo tanto, esta técnica se emplea para la detección de mutaciones, polimorfismos, hacer test de heterocigosidad y encontrar diferencias epigenéticas en las muestras de ácidos nucleicos.
• Priosecuenciador PyroMark Q24 (QIAGEN). Equipo para el análisis y cuantificación de la metilación en islas CpG de manera individual, análisis de SNPs, inserciones/deleciones, STRs, identificación de genes microbianos y de resistencia a antibióticos.

Otros 

Robot pipeteador QIAgility (QIAGEN) que permite una configuración rápida y de alta precisión de los experimentos de PCR y tambien preparación de diluciones seriadas. 

Lector Multimodo / Fluorescencia en Microplacas (BMG FLUOstar Omega). Aplicaciones específicas: ensayos de conversión de proteínas inducida por agitación en tiempo real (RT-QUIC), ensayos celulares (Ca2+, viabilidad, proliferación, etc.), ensayos genéticos, cuantificación de proteínas y ácidos nucleicos, inmunoensayos, ELISA, FRET, BRET, actividad enzimática, …

Por otra parte, en el laboratorio de Biología Celular disponemos de la siguiente infraestructura:

• Esclusa dotada de sistema de esterilización con luz ultravioleta.
• Material básico de laboratorio como micropipetas, multipipetas (8 canales), pipetas automáticas, sistema de agitación (vortex), centrífuga y microcentrífuga, sistema de aspiración Vacusafe, baño termostático, …
• Equipos de refrigeración y congelación.
• Cabina de seguridad biológica BIO-II-A (Telstar®).
• Estufa de incubación O2/CO2 MCO-170M-PE IncuSafe (Panasonic®).
• Incubador IN55, 53 L (Memmert).
• Microscopio invertido con contraste de fases y fluorescencia, Axio Vert.A1 (Carl Zeiss™). Gracias al contraste de fases, es posible visualizar cultivos celulares y tejidos sin necesidad de utilizar tinciones que pudieran dañar las estructuras celulares y modificar las condiciones del cultivo/tejido. Además, el estar equipado con un módulo de fluorescencia permite la visualización y seguimiento de elementos y/o componentes celulares marcados fluorescentemente. Aplicaciones específicas: experimentos de internalización, estudios inmunológicos, estudio de células normales y patológicas, visualizar partes de la célula, estudiar procesos celulares (división celular, muerte celular, cambios en el potencial de membrana), estudiar la interacción entre moléculas in vivo, estimación de la eficiencia de transfección, localización de proteínas, visualización de la expresión de proteínas fluorescentes, etc.
• ZOETM Fluorescent Cell Imager (Bio-Rad). Se trata de un sistema digital de imagen que permite la documentación de imagen de los cultivos celulares. Permite la visualización en campo claro y tres canales de fluorescencia (verde, azul y rojo). Aplicaciones específicas: estimación visual de la confluencia celular, determinar el estado general del cultivo, monitorización del crecimiento y proliferación celular, captura de imágenes (con o sin fluorescencia), visualización de la expresión de proteínas fluorescentes, localización de proteínas inmunofluorescentes, estimación de la eficiencia de transfección.
• Contador celular automático TC20 (Bio-Rad). Permite determinar el número total de células de un cultivo de manera sencilla, automática y rápida en un solo paso. Además, si se utiliza el reactivo azul de tripano, se puede evaluar la viabilidad celular del cultivo.
• Fotómetro para microplacas MultiskanTM FC (Thermo ScientificTM). Cuenta con un intervalo de longitud de onda de 340-850 nm. El instrumento ofrece mediciones rápidas y precisas que permiten una lectura completa de una placa de 96 pocillos. También está equipado con agitación lineal en serie. Permite una amplia variedad de aplicaciones específicas: estudios cinéticos de enzimas, ensayos de actividad enzimática, cuantificación de proteínas y ácidos nucleicos, ensayos ELISA, ensayos de señalización celular, viabilidad celular, apoptosis y más.